基因檢測
基因檢測
遺傳學檢測的新興技術
遺傳學檢測的新興技術

  植入前遺傳學診斷于上世紀90年代問世,作為產前診斷的替代方法。這個想法是要在將IVF胚胎轉移給母親之前,對單基因疾病進行遺傳診斷,并轉移表現出無疾病的胚胎,以期達到成功的目的。這樣可以避免對已確定的妊娠進行產前診斷,避免進行艱難的決策過程,并避免因不良后果而可能終止妊娠。當時PGD的發展取決于三項關鍵技術的幾乎同時發展:首先,體外受精使受精至第5天之間可以進入實驗室的早期人類胚胎,因此可以進行胚胎操作和活檢的方法被開發。其次,發明諾貝爾獎獲得者的聚合酶鏈反應,很快就可以將單個細胞的一小部分DNA指數擴增,從而使其易于進行突變分析,這是迄今無法用技術思考的壯舉可用。第三,比PCR稍晚一些,開發熒光原位雜交并將其用于檢測早期人類胚胎中的染色體異常。原位先前使用放射性探針使信號可視化來發展與染色體的選定序列互補的探針的雜交。除了使用放射性的危害和弊端外,還需要花費數周的時間才能得出結果。FISH使得在幾個小時的時間內計數多達五個不同的染色體成為可能。
   多年以來,已經開發幾種對胚胎進行采樣的方法,并在臨床上得到應用。原始論文描述了在發育的第3天,當它們大約有8個細胞時,對它們進行活檢。一到兩個細胞被取出并用于診斷,這一直引起人們對胚胎短期影響以及長期對胎兒出生的影響的擔憂。活檢的胚胎。提出一種侵入性較小的替代方案。用精子使卵母細胞受精后,受精卵母細胞排出了兩個極體,它們包含胚胎中母體遺傳物質的鏡像。這些極體沒有進一步的功能,通常會在進一步的發育過程中退化,但開發對該技術進行活檢的技術,并在單基因疾病的DNA水平或染色體水平對其進行分析。隨著IVF方法的進一步發展,體外培養胚胎成為標準的臨床實踐直到第5天,它們已經到達胚泡階段,被認為是分化為兩種不同細胞類型的第一個階段:將進一步發展為胚胎和胎兒的內部細胞團,以及稱為滋養外胚層的周圍細胞,將成為胎盤。大多數PGD中心具有在第3天幾乎放棄活檢,并已經轉向胚泡活檢因為這活檢定時具有許多優點。首先,通常在大約150個細胞中可以對5-10個細胞進行活檢,這使得基因診斷更加可靠且不易出錯。二,體外在培養過程中,由于自然選擇,通常只有約一半受精卵母細胞到達胚泡期。因此,需要分析的胚胎更少,從而減少了工作量和分析成本。第三,胚泡活檢被認為具有對胚胎存活率和植入電位比在第3天活檢較小不利影響。最后,如下文進一步解釋,胚泡活檢在很大程度上避免了第3天的染色體鑲嵌問題。最近,仍然處于臨床前開發階段,首次描述的囊胚液活檢。由PGD團隊在意大利博洛尼亞得到進一步發展。從完全膨脹的胚泡中回收液體不會造成傷害,囊胚的塌陷也是高效冷凍保存方法的一部分。胚泡液含有來自滋養外胚層和ICM的死細胞的DNA,因此通常忠實地代表胚胎的基因組。但僅約80%的囊胚液含有可分析的DNA,因此該方法尚未在臨床上普遍應用。此外,囊胚活檢與囊胚液的一致性尚不完全,這些差異的重要性仍需闡明。
   為了理解為什么在PGD中應用不同的技術,有必要知道已對其應用不同的指示。單基因疾病是PGD的第一個且仍被廣泛應用的指征。在第一個PGD循環中,使用PCR檢測Y染色體的重復序列來確定處于X連鎖遺傳疾病風險中的胚胎的性別。通過多重熒光PCR評估突變和連鎖標記以進行單倍型分析和可靠診斷,目前用于單基因組的PGD無需其他同時分析即可進行。該方法也廣泛用于有或沒有同時發生單基因診斷的HLA分型。HLA分型可以選擇與需要移植造血干細胞的患病同胞相同HLA類型的胚胎。這樣的例子是治療單基因疾病,例如鐮狀細胞性貧血或β地中海貧血,或獲得性疾病,例如不同形式的白血病。遺傳性染色體異常也已成為PGD的傳統適應癥。這些易位的攜帶者處于平衡后代的危險中,例如當羅伯遜易位涉及21號染色體時發生唐氏綜合癥。然而,平衡的易位攜帶者經常遭受亞生育力的困擾,因為它們要么反復遭受染色體異常概念的流產,要么是因為它們的胚胎懷孕是如此異常,以至于他們甚至無法成功植入。隨著FISH的出現,有可能確定胚胎是否具有平衡的染色體組成,即正常或平衡的轉運載體,或不平衡的染色體組。第一種情況是使用跨斷點的定制設計的熒光探針進行的,這意味著對于每個特定的易位,都必須設計和測試一組新的探針。相互易位通常是特定于一個家庭的,因此實際上需要為每個需要PGD的每個家庭重復進行這種廣泛的檢查。用于所有染色體的亞端粒或著絲粒區域的FISH探針在市場上可以買到并用不同的熒光染料標記時。任何易位病例都可以通過精心選擇的探針進行診斷:兩個用于羅伯遜易位。
   PGD使用FISH進行易位易位的原理。第一塊顯示正常情況,有兩個藍色染色體A和兩個黃色染色體B。藍色染色體的著絲粒標記為金色,而黃色染色體B的著絲粒標記為綠色,長臂的端粒標記為紅。藍色圓圈代表卵裂球的單個相間核,顯示兩個綠色,兩個紅色和兩個黃色的點。第二面板代表平衡的易位,例如由正常載體母體攜帶。藍色染色體A的長臂的很大一部分被黃色染色體B的一小部分所交換。由于沒有遺傳物質丟失,因此該個體在表型上是正常的。FISH結果與正常細胞沒有區別:兩個紅色,兩個綠色和兩個黃色點。第三幅顯示異常細胞:存在兩個正常的藍色染色體,一個正常的黃色染色體和一個帶有藍色部分的黃色染色體。該個體對于藍色染色體的一部分是三體的,對于黃色染色體的一部分是單體的。FISH結果顯示兩個黃色,兩個綠色亮起和一個紅色點。第四個面板顯示了另一個可能異常的例子:在基于FISH的染色體異常診斷的早期,很快就發現超過一半的人類植入前胚胎具有染色體非整倍體,其中許多在受精后的胚胎初次分裂時就出現。因此,推測這可能是重要的原因,甚至可能是常規IVF和ICSI期間植入水平低的原因。在接下來的幾年中,植入前基因測試的應用急劇增加,通過這種方式,可以在第3天對通過IVF進行妊娠的機會較少的夫婦的胚胎進行活檢,并分析細胞的染色體含量。如果僅轉移正常染色體的胚胎,這將增加孕婦的機率,例如孕產婦年齡較大,反復植入失敗或反復流產。然而,隨機上PGT-A的功效的權利要求對照試驗產生懷疑。造成這種情況的原因如下:FISH錯誤,第3天活檢導致胚胎受損,甚至是進行RCT的中心完全無能為力。但是,最主要的決定性原因是在第3天,許多胚胎都鑲嵌花序。盡管這一事實被確認在早期,這種現象的充分程度時,一天3個胚胎的每一個細胞進行全面的染色體分析只變得清晰。第3天的某些胚胎由正常細胞和具有非整倍性的細胞組成,而另一些僅具有異常細胞,并且此時每個細胞的異常都不同。這些被稱為混沌胚胎。這種現象稱為鑲嵌現象,仍然是該領域內激烈辯論的根源。質疑第3天胚胎顯示高度鑲嵌的概念,第3天的鑲嵌術很大程度上是由于陣列比較基因組雜交造成的技術錯誤,并證明aCGH在單細胞水平上的廣泛驗證和高度可靠性。全面的染色體篩選方法的出現至少意味著FISH錯誤不再起作用。然理想的是在第5天或第6天將胚泡轉移回子宮,盡管已證明胚泡能夠在第7天植入。因此,CCS最初應用于極體和使用慢速冷凍方案冷凍保存的胚胎,這意味著許多動物在解凍過程中丟失。隨著一種稱為玻璃化的高效冷凍保存方法的引入,囊胚活檢與CCS和玻璃化相結合成為可能,隨后在月經周期后融化和轉移整倍體胚胎。與第3天的胚胎相比,胚狀囊的發生率要低得多,因為更多的異常胚在第3天和第5天之間表現出發育停滯,因此,認為在第3天囊胚活檢可以規避鑲嵌問題。胚泡但使用CCS方法時也更容易檢測到。PGS2.0,如胚泡活檢和CCS已經到了被稱為的組合,現已廣泛應用并認為由許多作為必要的佐劑IVF,基于三個隨機對照試驗。然而,其他人在沒有足夠大的功率的隨機對照試驗仍持懷疑態度,并分析了正確的研究結果,特別是因為它表明鑲嵌囊胚仍然能夠植入和發育成正常懷孕和嬰兒。顯然,鑲嵌在人類植入前胚胎中的生物學意義在很大程度上仍是一個謎。
   在這里,將按首次使用的時間順序描述仍在使用或已全面開發的PGD方法。最初在PGD的第一個循環中應用的單細胞PCR很快變得不可靠,并導致誤診,主要是由于兩個技術難題。第一個是等位基因缺失,可以在雜合子細胞中觀察到,在雜合子細胞中,兩個等位基因中的一個僅在PCR反應中擴增,因此該細胞在分析時表現為純合子。第二個是細胞樣本被外源DNA污染,這種污染很容易在每個基因僅攜帶兩個拷貝或僅攜帶6pg或6×10–12gDNA的樣本中發生。已經開發出現代方法來避免或檢測這些誤診來源中的任何一種。通過在無菌環境中操作,使用專用的通風櫥并在PCR前和PCR后區域之間進行清晰隔離,可以避免污染。多重熒光PCR的引入有效地解決了等位基因的缺失。可以在自動化測序儀上高效分析已標記有熒光染料的PCR片段,并且將多個等位基因組合在一起即可檢測ADO。使用最廣泛的標記是高度多態的微衛星標記,例如,也用于親子鑒定中。目前,高效的PCRDNA聚合酶可輕松開發多重PCR,包括數量足夠多的PCR擴增子。除了更高的準確性外,這種類型的測定還減少工作量,因為它們可用于多個具有相同單基因疾病的家庭。實際上,與僅使用這些標記中的兩個進行測試相比,包含五個不同的多態性標記的分析對多個家族提供信息的可能性更高。已經為囊性纖維化開發了這種策略的一個例子,囊性纖維化是白種人中最常見的常染色體隱性遺傳疾病。
   PGD用于單基因疾病的原理,使用鏈接的標記物檢測等位基因缺失和污染。顯示了受囊性纖維化影響的母親,父親和孩子的基因型。父母是p.F508del突變的雜合子攜帶者,而他們的孩子是該突變的純合子。通過比較鏈接標記IVS17BTA的親本基因型,可以推斷出哪些等位基因與突變相關,以及等位基因與健康等位基因相關。顯示四個可能的后代和純合子受到影響。給出突變中的ADO實例,而微衛星中沒有突變。通常,對一種單基因疾病同時分析接近突變的五個或更多微衛星。將單細胞PCR的一種特殊形式稱為植入前遺傳單倍型。擴增單個細胞的完整DNA,以便從整個基因組中獲得足夠的量,以進行常規DNA診斷實驗室中使用的PCR分析。在這種情況下,用于全基因組擴增的方法是多重置換擴增。但此MDA并不完美,因此常規PCR后通常會出現ADO。因此,在PGH中,必須分析突變周圍的大量標記。最大的優點是,不必為每個尋求PGD的家庭建立特異性的單細胞PCR。在第3天,單細胞PCR仍被廣泛用于診斷單基因疾病,但可以預期,單基因PCR的PGD也可能與CCS結合用于囊胚活檢。可以從胚泡中活檢一個以上細胞的事實降低ADO的風險,并大大降低一種污染性DNA分子對基于五個或更多細胞的診斷的影響。盡管FISH已完全被PGT-A所取代,但在結構異常的情況下,它仍可用于診斷染色體失衡。FISH快速,便宜,而且由于有大量可用的標記探針,因此很容易適用于多種不同的情況。它可用于極體,第3天胚胎的單個卵裂球和胚泡。第一步,將單細胞沉積在玻璃顯微鏡載玻片上并固定。除去細胞膜和細胞質后,細胞核被透化使DNA探針到達細胞的DNA。探針將識別互補的細胞DNA序列并與其雜交。探針上的熒光標簽然后可以用紫外線顯微鏡可視化。FISH現在是在通過基于陣列或基于NGS策略被替換的過程中,尤其是對于復雜的重排,不能用FISH來解決。這些較新技術的另一個優點是避免了逐個患者的檢查。
   SNP是基因組的一個單一堿基對中的變化,不會導致單基因疾病,并且按慣例,其存在于至少1%的人口中。每個SNP有兩個等位基因,或兩個可能的堿基對。它們在人類基因組中非常豐富,目前已知約有1500萬。但它們不是隨機分布的,而是分為所謂的單元型模塊。這意味著,在DNA的某些段中只有一種類型的等位基因,可以發現,以使得例如5個SNP的拉伸將總共只顯示兩個或三個2的或32種可能性。這種單倍型的非隨機發生例如用于追蹤不同人群的祖先。這也是為什么SNP陣列不必詢問所有1500萬個SNP,而僅詢問一個代表完整單倍型基因組的原因。因此,典型的SNP陣列將帶有寡核苷酸或通常為25個堿基對的短DNA片段,與AffymetriXGeneChipHumanMapping250KNspI陣列的情況下的262,000個SNP的兩個等位基因互補。由于SNP陣列需要DNA量在納克范圍內,因此首先需要擴增一個或幾個細胞中存在的DNA。例如,已經使用GenomepleX單細胞全基因組擴增試劑盒結合AffymetriX250K陣列對攜帶已知染色體異常的單個淋巴細胞進行WGA驗證。使用內部開發的算法,將測試樣本中的等位基因與親本等位基因進行比較,這些作者還可以確定染色體或其部分的拷貝數。使用REPLI-g或GenomiPhi的MDA的基因分型準確度更好,而基于PCR的WGA的拷貝數評估則更好和更快。作為進一步的驗證,盲目的非選擇研究中證明CCS對胚泡活檢的預測價值。在分析之前對胚胎進行活檢和轉移,因此不了解任何測試結果。他們證明了CCS的陽性預測值,而整倍體結果對每個胚胎的繁殖潛能的陽性預測值為41.4%。
   顯示SNP陣列,陣列CGH和下一代測序之間的比較。對于這三種方法,擴增活檢細胞的DNA,以獲得足夠的DNA進行分析。示出測試樣品的一種SNP的基因型的三種可能性:純合AA,雜合AB和純合BB。雜合的AB樣品將探針均等結合,并在兩個探針上均發出相同的光;純合AA樣品將僅與A等位基因的探針結合,但與雜合子樣品的結合強度是雙倍強度,因此沒有DNA將與B等位基因的探針結合。BB基因型則相反。陣列包含數十萬個此類SNP,可提供有關母本或父本遺傳以及拷貝數的完整視圖。從外周血中提取的正常對照DNA標記為紅色,而擴增的胚泡DNA標記為紅色。將兩者混合并在包含覆蓋完整基因組的探針的陣列上共雜交。綠色和紅色DNA將競爭與陣列上探針的結合。如果對照和測試樣品中的DNA量相同,則該點將顯示為黃色。如果發出更多的紅光,則表明存在相對更多的對照DNA,因此測試樣品中有缺失。相反,如果發出更多的綠光,這表明測試樣品包含更多的DNA,因此是三體的。顯示NGS化學的一個例子。剪切擴增的DNA,并制備能夠與支持物共價結合的文庫。結合到支持物上的分子在被測序之前被擴增。生物信息學分析可以檢測單個堿基對的變化,以及部分染色體和整個染色體的插入或缺失。全彩在線提供。生物信息學分析可以檢測單個堿基對的變化,以及部分染色體和整個染色體的插入或缺失。全彩在線提供。生物信息學分析可以檢測單個堿基對的變化,以及部分染色體和整個染色體的插入或缺失。
   已經開發出所謂的“Karyomapping”,主要用于診斷單基因疾病,例如囊性纖維化。通過將MDA和Illumina陣列用于捐贈給研究的單個淋巴細胞和受影響的胚泡,可以通過將測試細胞的單倍型與親本或受影響的同胞的單倍型進行比較,從而建立高效的診斷。單核苷酸多態性和單倍型的全基因組計算大大補償MDA后發生的ADO。如果來自一個親本的單倍型和來自另一親本的一個單倍型都存在,或者在單性或部分缺失的情況下都不存在,則也可以檢測到染色體失衡。Karyomapping可以用作PGD的通用鏈接方法。在44個PGD循環中對25個單基因缺陷進行驗證之后,這些缺陷先前已經通過基于PCR的診斷方法進行診斷。證實55例臨床PGD病例中Karyomapping對單基因疾病的PGD的準確性和有效性。同時,一種使用Illumina陣列分析單細胞和小細胞樣品并與親本DNA進行比較以進行正確CNV分析的方法。在459個單細胞和134個單卵裂球上得到了驗證。使用該方法,同一小組最近發表來自27-35歲女性的22,599天3胚胎和15,112天5胚胎的數據,證實年齡對35歲以上女性胚胎中非整倍性的影響。在位于魯汶和比利時布魯塞爾的PGD中心之間進行合作。開發一種名為iChilds的算法,可以從父本和母本的單倍型中推斷出單個細胞的單倍型。通過比較不同的陣列平臺和WGA方法證明Illumina平臺與MDA一起使用是最有效的,并且由于iDAs的預放大,與iChilds的組合大大降低ADO。他們稱這種方法為“白蟻病”,它允許在基因型調用的基礎上進行拷貝數調用,并且已在單基因常染色體隱性遺傳,常染色體顯性遺傳和X連鎖疾病以及易位病例中得到驗證。其他小組也驗證了使用SNP陣列準確診斷羅伯遜或相互易位。馬斯特里赫特研究小組證明,與SNP陣列進行比較不僅可以針對具有不平衡核型的胚胎進行選擇,而且還可以在具有正常核型的胚胎和具有平衡核型的胚胎之間進行選擇。這將使患者能夠選擇只移植正常的胚胎,從而避免攜帶者的后代面臨他們不得不面對的同樣困難的生殖選擇。上面介紹的其他方法也適用于結構染色體異常的檢測。使用Natera技術開發他們自己的方法,并證明核型平衡的胚與不平衡核型的胚在胚泡形成率上的差異,研究小組將其工作流程應用于易位病例,并可以證明植入率之間沒有差異。正常和平衡的胚胎。
   通過將兩個DNA樣品共雜交到一個陣列,該陣列包含分散在基因組中的數千個DNA探針,aCGH將樣品的染色體含量與參照物進行“比較”。通常用紅色熒光染料標記的參考樣品與通常用綠色標記的測試樣品競爭,以便與可以固定在玻璃,塑料或硅表面的探針結合。然后測量從熒光標記發出的光:如果測試樣品和參考樣品包含相同數量的染色體,則發射的顏色將為黃色。如果測試樣品中存在其他染色體,例如,如果樣品來自21三體性患者,則發出的光將相對綠色。相反,如果測試樣品中的DNA較少,例如,在特納氏綜合癥的核型為45,X的情況下,X染色體發出的光會相對更紅。這些相對顏色用肉眼不可見,但是它們在陣列讀取器中進行測量,并通過生物信息學算法轉換為易于解釋的圖形形式。通常,X軸顯示從染色體1到Y的染色體上的位置,而Y軸顯示測試樣品和參考樣品中的強度比。如果參比樣品與樣品發出相同量的光,則顯示為Y軸零點。如果樣品發出更多的光,例如三體樣品,則將顯示為零以上的點。相反,一個45,X樣本將顯示X染色體上零以下的點。由于aCGH需要在納克范圍內的DNA量,因此首先需要擴增一個或幾個細胞中存在的DNA。結果表明,在PGH和SNP陣列中使用的MDA不能比其他類型的WGA更好地擴增第3天胚胎中單個卵裂球用于下游aCGH分析。特別為單細胞分析開發了高度可靠且便宜的陣列,其經證實的可接受的低錯誤率為0.7%。aCGH很快推出,取代FISH在PGD周期為復雜的遺傳重排,不適合于FISH分析或結合CCS。此時,胚胎仍主要在第3天執行或在極體上,盡管已經注意到向囊胚活檢的轉變。不久,臨床前和中試研究就發表,作為ESHRE的ESTEEM研究的一部分,aCGH分析在極體上均具有高效率和可靠性和上囊胚。陣列CGH還用于35歲以下患者囊胚的PGT-A的三個RCT中的一種,盡管該研究僅針對少數患者,因此功能不足。通過aCGH評估的具有染色體狀態的植入前胚胎的發育特征和形態之間的相關性。為了進行發育和形態評估,他們利用了在配備有攝像頭的恒溫器中生長的胚胎的延時,攝像頭以固定的間隔拍攝照片。卵裂的時間和持續時間,卵裂球的大小和規則性等幾個特征已被用來預測胚胎的植入潛能。可以預期,越來越多的生育中心將結合延時分析和CCS來優化最佳移植胚胎的選擇。
   內森·特里夫組開發定量PCR,它是數組格式的一種更快,更便宜的替代方法,能夠檢測整個染色體異常,但不能檢測片段異常,而不會降低診斷的準確性。他們采用一種用于測量基因表達的技術,從而測量了mRNA的豐度,從而可以用來測量染色體的拷貝數。使用市售的預擴增試劑盒與96個DNA拷貝數測定法一起對1至10個細胞的DNA進行預擴增,每個染色體四個。然后對預擴增的樣品進行實時定量PCR,能夠檢測到染色體數目的增加或減少。完成每個樣品過程的時間為4小時。該方法還可以用于遺傳結構異常,如易位,方法是簡單地添加涉及染色體斷裂點的特定檢測方法。該方法在帶有染色體異常的細胞系上均得到了充分驗證,如先前通過SNP陣列被診斷為非整倍體的71個胚胎。后來在臨床環境中顯示,帶有qPCR的CCS在臨床上能夠將整倍體與非整倍體胚胎區分開,作為選擇的工具,可用于連續100個具有較高孕產年齡的小患者群體中的選擇性單胚胎移植,臨床誤差率為0.21%。相同的基團隨后又在執行兩個隨機對照試驗表明其示出為整倍體與使用qPCR[CCS胚胎更高的著床率。具有qPCR的CCS:代表所有染色體的96種不同探針的多重擴增產生的DNA片段的比例取決于細胞的倍性。為9個橙色片段生成6個紅色和綠色片段。在定量PCR反應期間,將檢測到更多的橙色序列。顯示綠色和紅色序列的正常數目和橙色序列的比率為3。結果表明,采用qPCR的CCS的性能優于aCGH,后者顯示出更高的假陽性率。同一小組在一項多中心研究中證實非常高的一致性和可重復性,該研究分析2586個活檢的囊胚。實驗室對qPCR進行修改,使其包括單基因疾病或插入和缺失綜合征的診斷。通過添加專門為該家族中存在的突變以及側翼信息性SNP標記設計的拷貝數測定法,可以輕松實現這一目標。通過基于qPCR的PGD和CCS在17例患者中測試的152個胚胎中,所有患者均接受先前使用其他方法確定的正確診斷。來自43個病例的另外304個胚胎顯示出近100%的診斷,只有一個胚胎沒有定論。盡管相對便宜和快速,但是只有兩個實驗室例行使用此方法,這可能是因為與例如NGS相比其可能性有限。
   到本世紀初,隨著人類基因組計劃的部署,需要用于基因組測序的新技術。那時可用的Sanger測序技術雖然準確度高,效率高,但只能對短而清晰的DNA片段進行測序,例如受PCR產物長度的限制。用于全基因組測序的平臺和化學方法的開發獲得巨大的財務推動,從而產生了所謂的第二代或下一代測序。幾家公司銷售他們自己的平臺,但是它們的共同點是先將要測序的DNA切碎或切成小塊,然后再固定并固定在固體表面上,然后測序。然后將測序結果與大型數據庫或家族成員中的參考序列進行比較,以鑒定堿基對水平的突變或小的插入和缺失。例如,這可以確定受極端罕見單基因疾病影響的兒童中的突變,在那里需要大量家庭才能發現突變的經典位置克隆遺傳學無法應用。這種突變鑒定方法要求基因組中的每個序列都需要覆蓋合理的時間以確保準確性。通常,覆蓋率是30倍,這意味著基因組中的每個堿基對都要進行30次測序。因此這種類型的分析需要大量的輸入DNA,大量昂貴的消耗品以及非常強大的生物信息學分析,這使得這種類型的研究相當昂貴。相同的技術使無創產前診斷,識別和分析孕婦血液循環中存在的胎兒游離DNA的發展和飛速發展。但是,對于涉及完整染色體或較大染色體部分的較大染色體異常,更淺的覆蓋范圍就足夠了。現在腫瘤基因檢測網進入第三代測序,無需測序即可進行很長的單分子DNA測序,大規模并行測序也被廣泛用作表示整個基因組測序技術的統稱。至于陣列技術,單細胞水平的NGS需要對當前使用的大多數平臺進行DNA的預擴增。開發單個細胞上NGS的最早實例之一,使用基于PCR的GenomePleX擴增,然后對基因組的4–9.5%進行Hiseq2000低通測序,然后使用In-house算法,并允許檢測非整倍體和大于1Mb的CNV。分析單細胞和囊胚活檢組織,獲得99.63%的敏感性和97.71%的特異性。
   牛津大學的DaganWells小組證明,在第5天和第6天的活檢時間范圍內,使用離子洪流儀器進行極低通量的方案可以將CCS的費用降低到低于aCGH的費用。胚泡需要冷凍保存。為了進行驗證,在MDA后用RepliG對18個已知核型異常的單細胞,4個卵裂球和31個存檔的囊胚活檢進行測序,結果均為陽性,此后進行7例臨床PGT-A病例。CCS可以與PGD結合用于單基因疾病,例如用于囊性纖維化最常見的突變。首先,對MDA產物進行PCR以擴增突變周圍的95個堿基對,然后將該PCR產物加入NGS反應中,并測序至大約30倍的覆蓋深度。最后,使用他們的方案對線粒體DNA進行測序,并證明較低量的mtDNA與整倍性之間的相關性,這一發現在后來的工作中得到了證實。應用了為陣列的細胞遺傳學分析開發的Illumina的Bluefuse軟件,在Hiseq2000上對Illumina的工作流程進行修改,以進行用SurepleX預擴增的單細胞分析。該方法已在PGT-A和aCGH后從單個190個卵裂球獲得的已知異常的18個單細胞和WGA產物中得到驗證,證明了其高特異性和靈敏度。此處介紹的NGS協議還顯示對小至14Mb大小的節段變化的準確檢測,這表明部分非整倍性的診斷完全在該技術的能力范圍內。繼續在涉及雙盲平行評估的前瞻性試驗中證明了基于NGS的非整倍性測試的一致性比較他們的NGS方案和aCGH對55個連續臨床PGT-A周期中的192個胚泡的影響。使用IonTorrent平臺,同一小組分析從33對攜帶不同平衡易位的夫婦衍生的卵裂期胚胎或胚泡活檢中獲得的145種WGA產品。基于NGS的協議可靠地識別了162個片段不平衡,最小的可檢測染色體片段大小為5Mb。不平衡非整倍體胚胎發育的特異性和敏感性為100%。
   對于大于3Mb的分辨率,平均覆蓋度為0.3–0.4倍就足夠了,該臨界值是基于較大的CNV具有致病性而選擇的。較小的CNV家族分離并顯示為致病性也可以通過增加讀取深度來檢測。他們比較來自攜帶倒易位或羅伯遜易位的患者的47個胚泡活檢,這些活檢經SurepleX擴增并在IlluminaHiseq2000和IonTorrent上進行測序,并且可以證明與任一平臺的早期aCGH結果一致。這些作者還提請注意以下事實:如果從多個循環中采集樣品以實現高通量,則NGS的成本要低于aCGH。這可以通過冷凍保存活檢胚泡并在隨后的自然循環中使胚胎變暖和轉移來實現。在離子洪流平臺上,在使用IlluminaVeriseqPGS-Miseq試劑盒的MiSeqIllumina平臺上,后者著重于易位攜帶者的胚胎中的節段異常,就像先前顯示的帶有aCGH的攜帶節段異常的胚胎一樣。對植入前胚胎的分析超出對單基因疾病或染色體畸變的鑒定。應用功能強大的NGS平臺,長片段讀取技術以及CompleteGenomicsDNA納米陣列測序平臺,以檢測胚胎基因組中的從頭突變。這些從頭突變最近與導致自閉癥,嚴重的智力殘疾和癲癇性腦病有關,而針對PGD的方法和父母的攜帶者篩查會遺漏這些突變。
   毫無疑問,大多數PGD診所現在正朝著基于NGS的診斷方向發展,通常在胚泡期進行。與其他技術相比,它具有無數的優勢:遺傳性疾病,單基因和染色體疾病的診斷可以輕松與CCS結合使用,NGS的成本正在迅速下降,尤其是如果采用高通量方法,并且囊胚中的染色體鑲嵌可以比基于陣列的測試具有更高的靈敏度和更低的分辨率。然而,隨著對胚胎基因組的更深入分析,發現未知重要性的變體或具有已知作用的變體的風險隨之而來,但是準父母不一定會想知道這些變體。查看最新報告,似乎PGD和PGT-A的黃金標準目前在胚泡期的第5天進行活檢,并使用NGS進行基因分析。通常,囊胚玻璃化會留出更多時間進行分析,并匯集測試,從而降低成本。但是,此語句需要添加許多細微差別。盡管PGD可以代替產前診斷,但是用于遺傳性疾病的PGD仍然只是涉及胚胎基因檢測的全部活動的一小部分。此外,如果僅要測試所關注的缺陷,并且在這種情況下存在更便宜,更快捷的替代方法,那么在這種情況下,NGS幾乎就不需要擔保。也可以考慮添加CCS,類似于產前診斷,在該診斷中,還將檢查有單基因疾病風險的妊娠是否存在非整倍性,例如21三體性。但是,在PGD的末端通常很高,例如在常染色體顯性遺傳疾病中為50%。盡管對與活產兼容的非整倍性進行選擇性染色體分析,但為所有染色體添加PGT-A將進一步降低可用于轉移的胚胎數量。隨著NGS變得越來越便宜,并且開發了更具針對性的方法,可能性也越來越廣泛。但PGT-A的實踐是完全不同的事情。它通過縮短懷孕時間,減少植入失敗和反復流產而積極推廣為提高所有患者IVF效率的一種安全有效的方法。氣密RCT并沒有在適當的患者人群中可靠地證明這些主張,因此舉證責任仍然在PGT-A的支持者一方。最后,目前尚無關于對囊胚活檢和囊胚玻璃化后出生的孩子產生長期影響的數據。試管嬰兒的從業者有責任對這些孩子進行長期隨訪。
   NGS在PGT-A中的快速引入只是選擇最佳移植胚胎的一種方法。其他可以與PGT-A結合使用的方法是對胚胎進行延時觀察,或在用過的培養基中測量代謝產物。測量mtDNA或線粒體細胞器的數量可能代表一種額外的選擇工具。然而,確切的生物學意義仍然需要闡明。不斷發展的方法允許在單細胞水平上同時分析DNA,RNA和蛋白質。將有可能同時在染色體水平和堿基對水平上分析DNA,以及RNA序列或蛋白質,這些蛋白質或蛋白質是胚胎健康的標志。在單個細胞水平上同時分析DNA和RNA已經成為可能,這種技術將很快幫助腫瘤基因檢測網發現人類早期發育的分子基礎。然而,是否仍需要證明從最佳的卵巢刺激實驗中選擇最佳胚胎來獲得多個卵母細胞,以及在體外環境中在培養基中培養5天,是否是最佳策略。截至目前,它仍然認為,在本身PGT-A還沒有被證實有助于選擇最好的胚胎,更不用說與其他選擇工具組合。相反,從數百萬個植入前胚胎的觀察中收集到的知識應有助于腫瘤基因檢測網了解如何從最佳條件下成熟的卵母細胞開始,并在接近或什至超過輸卵子自然環境的培養基中培養最佳卵母細胞,以獲得最佳胚胎。植入前遺傳學診斷的目的是避免因受單基因或染色體遺傳病感染的胎兒與處于這些疾病風險中的夫妻而終止妊娠;PGD已被建議作為產前診斷的早期形式;通過IVF獲得胚胎,第3天一個細胞,或第5天,對一些細胞進行活檢以進行分析;大約50%的人類胚胎顯示出受精后出現的染色體異常,因此起源于有絲分裂且未遺傳;選擇不攜帶有絲分裂染色體異常的胚胎進行移植被稱為植入前基因檢測,盡管對PGT-A的效率尚無共識,但據認為可以改善IVF結果。多重熒光PCR是診斷單基因疾病的最簡單方法;診斷遺傳性結構異常的最簡單方法是熒光原位雜交;Array-CGH已建立完善并廣泛用于全面的染色體檢測,并且已用于遺傳性結構異常和PGT-A;SNP陣列更為復雜,已用于PGT-A,遺傳性結構異常和單基因疾病診斷,或其組合;PGD和PGT-A的下一代測序正在許多PGD中心引入,并且可以擴展到線粒體DNA分析和從頭突變分析。只有冷凍保存胚胎,NGS才具有成本效益,以便可以收集和分析大量樣本。

 
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